日本EGF協会認定原料および化粧品の活性測定試験


培養細胞を用いたEGFの活性測定

試験報告書

1.試験名
  培養細胞を用いたEGFの活性測定
2.試験期間
   201191日から2011118
3.試験目的
  協会認定原料および化粧品についてEGF活性を測定し、認定基準要件を満たしているかどうかを調べる。
4.被験物質
  次の2種類の被験物質を使用した。表1に示す
1.被験物質
被験物質番号
1
2
本報告書における被験物質名
協会認定EGF原料
協会認定化粧品
品名
ヒトオリゴペプチド-1
EGFエクストラエッセンス
ロット番号またはBatch No.
2011030120113月製造)
KH1 (20118月製造)
性状
白色の凍結乾燥粉末
無色透明の液体
公称EGF濃度
0.167μg/mL
公称活性
1.13x106IU/mg
167IU/L
容量
1mg入りバイアル
60mL入りボトル
試験開始までの保存方法
冷蔵庫保存
常温保存
―:記載なし


5.陽性対照物質
The National Institute for Biological Standards and Control(以下、NIBSC)から入手した標準EGF
陽性対照物質として使用した。表
2に示す。
2.陽性対照物質
本報告書における
陽性対照物質名
標準EGF
品名
EPIDERMAL GROWTH FACTOR (EGF) Human, rDNA-derived
販売元および品番
NIBSC code: 91/530
ロット番号
性状
凍結乾燥物
活性
2000IU/アンプル
活性測定に使用した細胞
Balb/c 3T3
容量
2μg/アンプル
比活性
1.00×106IU/mg EGF
貯法
-40℃以下の保存を推奨
保存方法
溶解後は-80℃に設定した冷凍庫内で保存

6.細胞
(独)理化学研究所、バイオリソースセンター細胞材料開発室(RIKEN Cell Bank)から入手した
BALB/3T3 clone A31を使用した。表3に示す
3.細胞
細胞名
BALB/3T3 clone A31
本報告書における細胞名
A31
由来
マウス胎児(BALB/c
ロット番号
013
購入時継代数
不明
細胞数、本数
1.3×106/バイアル、1


7.活性測定条件
概要を表4に示す。
4.活性測定条件の概要
測定対象
EGF
測定時の培地
0.5%FBS、ゲンタマイシン10μg/mLを含むMEM
細胞播種密度
2x103/well96well plate
培養条件
37℃、5%CO2
培養日数
播種後1日に被験物質または陽性対照物質を含む
上記培地に 交換し、
5日間
細胞数の測定法
PicoGreen ® dsDNA Reagent(インビトロジェン社)に
よる
DNAの定量


8.試験方法
8-1.試験物質の調製
被験物質は試験開始時まで冷蔵庫にて保存した。凍結乾燥された被験物質及び陽性対照物質については、
1mg/mLウシ血清アルブミン含有PBSで溶解した後、使用時まで−80℃で保存した。
8-2EGFの活性測定
10%FBS10μg/mLゲンタマイシンを含むMEMを用いて、37℃、5%CO2条件下で培養し、安定的に増殖させたA31
試験に使用した。
A31細胞を96wellプレートに2x103/well5%FBS含有培地で播種して培養した。培養後24時間に、
0.5%FBS含有培地にて段階的に希釈した試験物質を含む培地に交換して、さらに5日間培養した。
試験物質を公比
1.5あるいは2.25で段階希釈し、各濃度あたり3wellを使用した。EGF活性は、粉末試料について
ED50ng/mL)および国際単位による比活性(IU/mg EGF)として、溶液試料についてはED50nL/mL
および国際単位濃度(
IU/mL)として表記した。EGF濃度既知の溶液試料については、国際単位による
比活性(
IU/mg EGF)も算出した。
細胞を1%NP-40含有緩衝液にて溶解した後、ウシ胸腺DNAを標準としてPicoGreen ® dsDNA Reagentを用いて測定した。
3wellの結果の平均値を算出し増殖曲線を作成した。
DNA量はwell当たりのDNA量として表記した。また、EGFの濃度を横軸、EGF非添加(ブランク)のDNA量を0
最も高い
DNA量を1としたDNA ratioを縦軸とした 増殖曲線を作成し、ED50の値を算出した。


9.結果
91-1.陽性対照物質(標準EGF)測定結果
試験は2回実施(試験1、試験2)した。増殖曲線を図1及び2に示す。標準EGFは、0.585ng/mL4.44ng/mLあるいは
6.67ng/mLの間において、濃度依存的な増殖促進作用を示した。また、得られた結果に基づいて、ED50の算出用に
使用した回帰曲線の結果を図
3及び4に示す。試験1ED501.06ng/mL、試験2ED500.816ng/mL
平均値は
0.938ng/mLであった。
1A31に対する標準EGFによる増殖曲線(試験1
縦軸は細胞数の指標であるDNA量、横軸はEGF濃度を示す。


2A31に対する標準EGFによる増殖曲線(試験2
縦軸は細胞数の指標であるDNA量、横軸はEGF濃度を示す。



3A31に対する標準EGFによる増殖促進のED50(試験1
ED50
付近の結果7点に基づいて、3次元多項式を用いて算出したED501.06ng/mLであった。
図中の式は
3次元多項式、Rは相関係数を示す。


4A31に対する標準EGFによる増殖促進のED50(試験2
ED50付近の結果6点に基づいて、3次元多項式を用いて算出したED500.816ng/mLであった。
図中の式は
3次元多項式、Rは相関係数を示す。


9-1-2標準EGFのまとめ
5に示す。標準EGFED50を(独)理化学研究所から入手したBALB/3T3 A31を用いて測定した結果、
0.938ng/mLと算出された。ED50の値から算出された比活性は1.07×106IU/mg EGFで、
添付文書に記載されている値から算出した比活性である
1.00×106IU/mg EGFと同様であった。
5.標準EGFのまとめ
資料
使用細胞
ED50
比活性
標準EGF
添付文書
Balb/c 3T3
1.00ng/mL
(比活性からの換算値)
1.00×106IU/mg EGF
本試験報告書
BALB/3T3 A31((独)理化学研究所)
1回目:1.06ng/mL
2
回目:0.816ng/mL
平均:0.938ng/mL
1.07×106IU/mg EGF


9-2-1.協会認定EGF原料測定結果
試験は2回実施(試験1、試験2)した。結果を図5及び6に示す。試験1及び試験2ともに、
協会認定
EGF原料は0.585ng/mLから2.96ng/mLの間で濃度依存的な増殖促進作用を示した。
ED50の算出用に使用した回帰曲線の結果を図7及び8に示す。
試験
1ED500.988ng/mL、 試験2ED500.996ng/mL、平均は0.992ng/mLであった。
5A31に対する協会認定EGF原料による増殖曲線(試験1
縦軸は細胞数の指標であるDNA量、横軸はEGF濃度を示す。


6A31に対する協会認定EGF原料による増殖曲線(試験2
縦軸は細胞数の指標であるDNA量、横軸はEGF濃度を示す。



7A31に対する協会認定EGF原料による増殖促進のED50(試験1
ED50付近の結果5点に基づいて、3次元多項式を用いて算出したED500.988ng/mLであった。
図中の式は
3次元多項式、Rは相関係数を示す。


8A31に対する協会認定EGF原料による増殖促進のED50(試験2
ED50付近の結果7点に基づいて、4次元多項式を用いて算出したED500.996ng/mLであった。
図中の式は
4次元多項式、Rは相関係数を示す。
9-2-2.協会認定EGF原料のまとめ
6に示す。協会認定EGF原料について、BALB/ 3T3 A31に対するED50を測定した結果、
0.992ng/mLと算出された。ED50の値から算出された比活性は1.01×106IU/mg EGFで、
CoAに記載されている比活性である1.13×106IU/mg EGFと同程度であった。
6協会認定EGF原料のまとめ
資料
使用細胞
ED50
比活性
協会認定EGF原料
Lot.20110301)のCoA
記載なし
0.885ng/mL
(比活性からの換算値)
1.13×106IU/mg EGF
本試験報告書
BALB/3T3 A31((独)理化学研究所)
1回目:0.988ng/mL
2
回目:0.996ng/mL
平均:
0.992ng/mL
1.01×106IU/mg EGF



9-3-1.協会認定化粧品(EGFエクストラエッセンス)測定結果
エクストラエッセンスは、溶液試料として供給された。試験は2回実施(試験1、試験2)し、結果を図21及び22に示す。
試験
1及び試験2ともに1.95μL/mL22.2μL/mLの間で濃度依存的な増殖促進作用が認められた。
また、得られた結果に基づいて、
ED50の算出用に使用した回帰曲線の結果を図23及び24に示す。
試験
1ED505.55μL/mL5550nL/mL)、試験2ED506.24μL/mL6240nL/mL)、
平均値は
5.90μL/mL5900nL/mL)であった。
21A31に対するエクストラエッセンスによる増殖曲線(試験1
縦軸は細胞数の指標である
DNA量、横軸は試料溶液濃度を示す。


22A31に対するエクストラエッセンスによる増殖曲線(試験2
縦軸は細胞数の指標である
DNA量、横軸は試料溶液濃度を示す。

23A31に対するエクストラエッセンスによる増殖促進のED50(試験1
ED50
付近の結果7点に基づいて、3次元多項式を用いて算出したED505.55μL/mL5550ng/mL)であった。
図中の式は
3次元多項式、Rは相関係数を示す。


24A31に対するエクストラエッセンスによる増殖促進のED50(試験2
ED50付近の結果6点に基づいて、3次元多項式を用いて算出したED506.24μL/mL6240nL/mL)であった。
図中の式は
3次元多項式、Rは相関係数を示す。

9-3-2協会認定化粧品(EGFエクストラエッセンス)のまとめ
7に示す。エクストラエッセンスED50について、A31を用いて測定した結果、
5.90μL/mL5900nL/mL)と算出された。ED50から算出された国際単位濃度は169IU/mLであった。
エクストラエッセンスのEGF濃度は0.167μg/mLであるので、当該被験物質のEGFとしてのED500.985ng/mL
比活性は
1.01×106IU/mg EGFと算出された。
7エクストラエッセンスのまとめ
資料
使用細胞
ED50
国際単位濃度
比活性
エクストラエッセンスの
公称
記載なし
記載なし
10,000IU/60L
記載なし
本試験報告書
BALB/3T3 A31((独)理化学研究所)

1回目:5550nL/mL
2回目:6240nL/mL
平均:5900nL/mL

169IU/mL10,140IU/60L
1.01×106 IU/mg EGF



10.考察
本試験において測定された標準EGFED500.938ng/mLで、この値から算出される比活性は1.07×106IU/mg EGFであった。
この値は標準
EGFの添付文書に記載されている値から算出される比活性である1.00×106IU/mg EGFとほぼ同じであった。
以上の結果は、本試験で測定された
EGFED50値を補正することなく、そのまま国際単位に変換できることを示している。
協会認定EGF原料のED50及び比活性は標準EGFと同様の値を示し、1.01×106IU/mg EGFの比活性は、
CoA記載の比活性である1.13×106IU/mg EGFと大きな差がなかった。
これにより、協会認定EGF原料は、ほぼ公称どおりの良好な生物活性を有し、冷蔵庫保存での品質、生物活性の
劣化はみられなかった。

協会認定化粧品(
EGFエクストラエッセンス)の国際単位濃度は169IU/mLで、
1商品あたり10,140IU/60Lの活性を有することが判明した。
協会認定化粧品(EGFエクストラエッセンス)は 製造後常温保存でも生物活性の劣化がなく、
協会認定原料と同様な比活性の
EGF0.167μg/mLの濃度で 配合した被験物質であることが確認された。


11.文献
1.Instructions for use: WHO International Standard, EPIDERMAL GROWTH FACTOR (EGF) Human,
  rDNA-derived, NIBSC code: 91/530,
2.ヒトオリゴペプチド-1(Batch No. 20110301)Certificate of Analysis
以上