日本EGF協会認定原料(
aFGF KGF)の細胞増殖性能比較試験

当協会では、下記の通り細胞増殖性能比較試験を実施いたしましたので、結果ご報告させていただきます。

1 試験の目的
元来aFGF(FGF-1)と、KGF(FGF-7)は、とても高価な原料であり、当協会が認定している原料が細胞増殖能力を本当に備えているのか、
また、高価な標準品との比較でもその能力が劣っていないのかどうかを調べると同時に、入手することができた他社のaFGF化粧品原料との比較も行う。
さらに結果から当協会の認定最低基準濃度で細胞増殖効果が認められるかどうかを検証する。
2      試験期間
2011330日から201163
3      試験方法
aFGF
)理化学研究所、バイオリソースセンター細胞材料開発室(RIKEN Cell Bank)から入手したBALB/3T3 clone A31(マウス胎児の線維芽細胞)を用いて、
設定された測定条件に従って、増殖曲線を作成した。

KGF
American Type Culture CollectionATCC)から入手した4MBr-5(サルの上皮細胞株)を用いて、
設定された測定条件に従って、増殖曲線を作成した。
4  測定条件の概要は表1の通り

 1.活性測定条件の概要

 

測定対象
aFGF
KGF
測定時の培地
0.1%FBS、ゲンタマイシン 10μg/mL、
ヘパリンナトリウム10μg/mLを含むMEM
5%FBS、ゲンタマイシン10μg/mL
含む
F-12K Nutrient Mixture
細胞播種密度
2x103cells/well96well plate
2x103cells/well96well plate
培養条件
37℃、5%CO2
37℃、5%CO2
培養日数
播種後1日に被験物質または
陽性対照物質を含む上記培地に
交換し、
5日間
播種後1日に被験物質または
陽性対照物質を含む上記培地に
交換し、
5日間
細胞数の測定法
PicoGreen ® dsDNA Reagent
(インビトロジェン社)による
DNAの測定
PicoGreen ® dsDNA Reagent
(インビトロジェン社)による
DNAの測定



5 被験物質

aFGFは表2のとおり、KGFは表3のとおり。

表2.被験物質 aFGF

被験物質番号
1
2
3
本報告書における
被験物質名
R&DaFGF
日本EGF協会認定aFGF
C社化粧品原料aFGF
性状
白色の凍結乾燥粉末
白色の凍結乾燥粉末
透明な液体
濃度
1ppm1μg/mL
活性規格
ED500.10.3ng/mL
2.5×105IU/mg以上
ED500.2ng/mL以下
活性測定に使用した
細胞
NR6R-3T3
Balb 3T3
NIH3T3
容量、本数
25μg入りバイアル1
2.5mg入りバイアル1
30g入りバイアル1
有効期限
-20℃〜-70℃で保存する
とき、入手後12ヶ月
2011127
201219
価格
\36,000/25μg*1
非公開
保存方法
入手後、使用時まで
冷蔵保存。溶解後は

-80
℃に設定した
冷凍庫内で保存。
入手後、使用時まで
冷蔵保存。溶解後は
-80℃に設定した
冷凍庫内で保存。
入手後、使用時まで
冷蔵保存。
1 換算すると1μgあたり1,440円、当協会認定aFGF原料1本(2.5mg)あたりでは3,600,000円になります。


3.被験物質KGF
被験物質番号
4
5
本報告書における
被験物質名
R&DKGF
日本EGF協会認定KGF
性状
白色の凍結乾燥粉末
白色の凍結乾燥粉末
濃度
活性規格
ED501525ng/mL 
2.0×105IU/mg以上
活性測定に使用した細胞
4MBr-5
4MBr-5
容量、本数
10μg入りバイアル1
5mg入りバイアル1本
有効期限
-20℃〜-70℃で保存するとき、
入手後
12ヶ月
201091日 *1
価格
55,000/10μg *2
非公開
保存方法
入手後、使用時まで冷蔵保存。
溶解後は
-80℃に設定した
冷凍庫内で保存。
入手後、使用時まで冷蔵保存。
溶解後は
-80℃に設定した
冷凍庫内で保存。
  1 原料の表示上は2010年9月1日が有効期限ですが、凍結乾燥粉末を冷蔵保存していれば
    有効期限が過ぎても活性があることを証明する為に、あえて有効期限切れの原料を使用しました。
  2 換算すると1μgあたり5,500円、当協会認定KGF原料1本(5mg)あたりでは27,500,000円になります。





 6 測定結果
 6-1 R&DaFGF
試験は2回実施(試験1、試験2)しました。増殖曲線は図1及び2のとおりです。この標準品での試験結果でA31線維芽細胞の
増殖活性が示されたことから、この測定モデルは有効なものであることが示されました。
R&DaFGFは2回の試験のどちらも
16ng/mLあたりで能力のピークを打ち、DNA量がaFGF非添加時の3倍程度になっていることが判ります。
この原料を化粧品に使用するとすれば、細胞増殖能力を示す濃度のレンジが狭いため、高濃度で配合すれば効果が低くなる可能性があり、
また低濃度で配合すれば、経時的に失活した場合に効果が無くなるというリスクを伴うことが考えられます。

 
1A31に対するR&DaFGFによる増殖曲線(試験1
縦軸は細胞数の指標である
DNA量、横軸はaFGF濃度の対数を示す。


2A31に対するR&DaFGFによる増殖曲線(試験2
縦軸は細胞数の指標である
DNA量、横軸はaFGF濃度の対数を示す。





 6-2日本EGF協会認定aFGF
試験は2回実施(試験1、試験2)しました。結果は図3及び4のとおりです。
日本EGF協会認定
aFGF 1000ng/mL付近までの第一の活性と、1000ng/mL以上16000ng/mL付近までの
第二の活性の
2つの活性が重なって存在するような挙動を示しました。
この結果から、日本EGF協会認定
aFGF10ng/mL〜20μg/mLないしはそれ以上の幅広いレンジで線維芽細胞の
増殖効果を発揮することが判明しました。細胞増殖能力は試験
1では10,000ng/mL超付近でピークを打ち、
DNA量が非添加時の
45倍程度になっていることが判ります。また試験2ではピークが存在せず、
最高でDNA量が非添加時の
89倍になっています。R&D社のaFGFと比較すると、
超低濃度領域(
10ng/mL付近)ではR&D社のaFGFの細胞増殖能力が勝っているものの、その辺りで能力のピークを打ち、
日本EGF協会認定
aFGF はそれより高濃度になればなるほど細胞増殖能力が増していくことがわかります。
この試験では線維芽細胞を5日間
aFGFにさらしている状態での結果ですので、1日に1回ないしは2回程度皮膚に塗布する
といった用法であれば、条件によっても差が出ますが、おおよそ実験での
100倍程度の濃度で同じ効果が
得られるのではないかと考えられます。
つまり、1μg
/mL2mg/mLの範囲であれば、濃度に応じて細胞増殖能力が高くなると推測されます。
日本EGF協会の
aFGFの認定濃度はこの被験原料で1.6μg/mL以上となっており、
当協会の認定最低基準濃度で細胞増殖効果が充分認められると考えられます。
3A31に対する日本EGF協会認定aFGFによる増殖曲線(試験1) 縦軸は細胞数の指標であるDNA量、横軸はaFGF濃度の対数を示す。
増殖促進活性は低濃度側と高濃度側の
2つの濃度領域でみとめられ、増殖曲線は階段状となった。


4A31に対する日本EGF協会認定aFGFによる増殖曲線(試験2)縦軸は細胞数の指標であるDNA量、横軸はaFGF濃度の対数を示す。
増殖促進活性は低濃度側と高濃度側の2つの濃度領域でみとめられ、増殖曲線は階段状となった






6-3  C社化粧品原料aFGF
C社化粧品原料aFGFは、ブチレングリコールを添加剤として含むaFGF 1μg/mL溶液であるため、aFGFの最高濃度をその1/10100ng/mLとしました。
試験は
2回実施(試験1、試験2)しました。結果は図5及び6のとおりです。試験1及び試験2ともに増殖促進活性は認められず、
むしろ高濃度では濃度依存的な
DNA量の減少、すなわち増殖の抑制が認められました。
この原料の規格は
ED500.2ng/mL以下となっており、R&D社aFGFとほぼ同じでしたが、実際は効果が無いという残念な結果になりました。
理由としては
aFGF自体が最初から入っていなかったということや、aFGFがすでに失活していたということなどが考えられます。
さらに逆に増殖の抑制が認められたということは、液体原料に含まれているそのほかの成分(ブチレングリコールなど)の影響が考えられます。

この原料をどれほど高濃度に配合しても、まったく効果が無いということになります。
5A31に対するCaFGFによる増殖曲線(試験1)縦軸は細胞数の指標であるDNA量、横軸はaFGF濃度の対数を示す。
増殖促進活性は認められず、高濃度では濃度依存的なDNA量の減少、すなわち増殖の抑制が認められた。


6A31に対するCaFGFによる増殖曲線(試験2)縦軸は細胞数の指標であるDNA量、横軸はaFGF濃度の対数を示す。
増殖促進活性は認められず、高濃度では濃度依存的なDNA量の減少、すなわち増殖の抑制が認められた。












6-4  R&DKGF
試験は2回実施(試験1、試験2)しました。結果を図7及び8のとおりです。
試験
1及び試験2ともに、4000ng/mLまで濃度依存的にDNA濃度の増加が認められました。
この標準品での試験結果で
4MBr-5上皮細胞の増殖活性が示されたことから、この測定モデルは有効なものであることが示されました。
R&DKGFは2回の試験のどちらも10,000ng/mL弱あたりで能力のピークを打ち、DNA量が非添加時の3.54.5倍程度になっていることが判ります。
細胞増殖能力を示す濃度のレンジがそれなりに広く、10ng/mL〜10μg/mLで濃度依存的に細胞増殖能力がアップするようです。
ただし、10μgが55,000円ですので、コスト面で化粧品に利用できそうにありません。
74MBr-5に対するR&DKGFによる増殖曲線(試験1
縦軸は細胞数の指標である
DNA量、横軸はKGF濃度の対数を示す。

84MBr-5に対するR&DKGFによる増殖曲線(試験2
縦軸は細胞数の指標であるDNA量、横軸はKGF濃度の対数を示す。






6-5 日本EGF協会認定KGF
試験は2回実施(試験1、試験2)しました。結果は図9及び10のとおりです。
試験
1及び試験2ともに125あるいは250ng/mLまで、概ね濃度依存的に細胞増殖能力は増加し、
ピークではDNA量が非添加時の
4倍程度になっていることが判ります。
ピークは
125250ng/mLあたりでむかえるものの、それ以上の高濃度領域でもそれなりにDNA量の増加が見られ、
細胞増殖能力を示す濃度のレンジは、低濃度(
0.1ng/mL)から高濃度(10μg/mL)までと広いようです。
R&D社のKGFと比較すると、低濃度から活性が認められ、活性ピークの濃度が低く、
ピーク時の細胞増殖能力はほぼ同じであるということがわかります。
この試験では4MBr-5上皮細胞を5日間KGFにさらしている状態での結果ですので、
1日に1回ないしは2回程度皮膚に塗布するといった用法であれば、条件によっても差が出ますが、
おおよそ実験での
100倍程度の濃度で同じ効果が得られるのではないかと考えられます。
つまり、10n/mL25μg/mLの範囲であれば、濃度に応じて細胞増殖能力が高くなるなり、
1mg/mL
まで効果が認められると推察されます。
日本EGF協会のKGFの認定濃度はこの被験原料で0.2μg/mL以上となっており、
当協会の認定最低基準濃度で充分細胞増殖効果が認められると考えられます。

94MBr-5に対する日本EGF協会認定KGFによる増殖曲線(試験1
縦軸は細胞数の指標である
DNA量、横軸はKGF濃度の対数を示す。

104MBr-5に対する日本EGF協会認定KGFによる増殖曲線(試験2
縦軸は細胞数の指標である
DNA量、横軸はKGF濃度の対数を示す。
 




以上

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